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Molekulare Diagnostik

Zusätzlich zur mikroskopischen Untersuchung können die Zellen in Gewebeproben -  selbst nach Formalinfixation und Paraffineinbettung – molekularpathologisch untersucht werden. Die molekularpathologische Untersuchung von Zellen hat die Feststellung von Mutationen zum Ziel. Die Erfassung und Analyse von Mutationen sind wesentliche Schritte für die Verbesserung und Individualisierung der Therapie, besonders von Tumorerkrankungen. Die Verbesserung und Individualisierung der Therapie sind erklärte Ziele der Präzisionsmedizin.

In unserem Institut für Pathologie kommen zwei Methoden zum Einsatz, um Mutationen im Tumorgewebe zu analysieren:

  1. eine auf der quantitativen Polymerase-Ketten-Reaktion (qPCR) basierte Analysemethode
  2. ein Next Generation Sequencing (NGS) Verfahren

Das qPCR basierte System liefert schnell Ergebnisse - Ziel sind 2 Tage von der Anforderung zum Befund - und ist relativ kostengünstig. Wir setzten hier das Idylla™ System der Firma Biocartis ein. Das Idylla™-System ist ein automatisiertes System für die schnelle und sensitive qPCR-basierte Molekulardiagnostik. Dieses System ist eine Komplettlösung mit einer automatisierten Probenaufarbeitung inklusive qPCR-Amplifikation und automatischer Erkennung von PCR Produkten als Grundlage der Feststellung von Muationen. Das qPCR basierte System wird von uns auch im Rahmen der Analyse von Liquid Biopsies eingesetzt. Bei Liquid Biopsies können molekularpathologische Untersuchungen von Tumoren auch an Blutproben durchgeführt werden.

 

Zur Analyse von Mutationen in Tumorgewebe durch NGS setzten wir das Genexus™ System der Firma ThermoFisher ein. Dieses System ist ein hochautomatisiertes, Amplikon basiertes NGS System. Das NGS Verfahren wird von uns zur Analyse von Mutationen multipler Gene eingesetzt. Hierbei setzen wir hauptsächlich drei Assays ein, die sich in der Zahl untersuchter Gene unterscheiden. Die Kosten wie auch die Analysezeiten sind abhängig vom gewählten Assay. Ziel ist ein Zeitraum von 7 Tagen zwischen Anforderung und Befund.

Es stehen derzeit drei Assays zur Verfügung:

  1. Oncomine Precision Assay
  2. Oncomine Comprehensive Assay

IdyllaTM System der Firma Biocartis

Es stehen Kartuschen zur Verfügung mit denen verschiedene zell- und gewebs-basierte Assays wie auch blutbasierte Assays, sogenannte Liquid Biopsies, durchgeführt werden können. Methodisch bedingt kann nur eine limitierte Anzahl von Genen und eine definierte Anzahl von Mutationen in einem Run analysiert werden.

 

Zell- und gewebsbasierte Assays

  • EGFR Mutationsanalyse
  • KRAS Mutationsanalyse
  • BRAF Mutationsanalyse
  • NRAS & BRAF Mutationsanalyse
  • MSI Analyse

 

Liquid Biopsies = blutbasierte Assays

  • EGFR Mutationsanalyse
  • KRAS Mutationsanalyse
  • NRAS & BRAF Mutationsanalyse

Wird die Analyse einer Liquid Biopsy gewünscht, muss eine entsprechende Probeneinsendung beachtet werden.

GenexusTM System der Firma ThermoFisher

Das Genexus System besteht aus zwei Geräten. Im ersten erfolgt die DNA und RNA Reinigung und Quantifizierung, im zweiten Gerät erfolgt die Amplifikation und die Sequenzierung. Es kommen in diesen hochautomatisierten Geräten verschiedene Assays zum Einsatz, die sich in der Zahl der untersuchten Gene unterscheiden. Da formalinfixiertes und paraffineingebettetes Probenmaterial in den Assays eingesetzt werden kann, können auch Proben, die vor Jahren eingebettet wurden, heute meist erfolgreich molekularpathologisch untersucht werden.

 

Derzeit eingesetzte Assays

  1. Oncomine Precision Assay
  2. Oncomine Comprehensive Assay

 

Oncomine Precision Assay

DNA hotspot


AKT1    AKT2    AKT3    ALK    AR    ARAF    BRAF    CDK4    CDKN2A    CHEK2    CTNNB1    EGFR    ERBB2    ERBB3    ERBB4    ESR1    FGFR1    FGFR2    FGFR3    FGFR4    FLT3    GNA11    GNAQ    GNAS    HRAS    IDH1    IDH2    KIT    KRAS    MAP2K1    MAP2K2    MET    MTOR    NRAS    NTRK1    NTRK2    NTRK3    PDGFRA    PIK3CA    PTEN    RAF1    RET    ROS1    SMO    TP53   

CNV (=copy number variation)

ALK    AR    CD274    CDKN2A    EGFR    ERBB2    ERBB3    FGFR1    FGFR2    FGFR3    KRAS    MET    PIK3CA    PTEN   

 

Fusions

ALK    BRAF    ESR1    FGFR1    FGFR2    FGFR3    MET    NRG1    NTRK1    NTRK3    NUTM1    RET    ROS1    RSPO2    RSPO3    AR    EGFR    MET

 

Oncomine Comprehensive Assay

 

DNA hotspots

AKT1    FGFR4    MED12    SRC    AKT2    FLT3    MET    STAT3    AKT3    FOXL2    MTOR    TERT    ALK    GATA2    MYC    TOP1    AR    GNA11    MYCN    U2AF1    ARAF    GNAQ    MYD88    XPO1    AXL    GNAS    NFE2L2    BRAF    H3F3A    NRAS    BTK    HIST1H3B    NTRK1    CBL    HNF1A    NTRK2    CCND1    HRAS    NTRK3    CDK4    IDH1    PDGFRA    CDK6    IDH2    PDGFRB    CHEK2    JAK1    PIK3CA    CSF1R    JAK2    PIK3CB    CTNNB1    JAK3    PPP2R1A    DDR2    KDR    PTPN11    EGFR    KIT    RAC1    ERBB2    KNSTRN    RAF1    ERBB3    KRAS    RET    ERBB4    MAGOH    RHEB    ERCC2    MAP2K1    RHOA    ESR1    MAP2K2    ROS1    EZH2    MAP2K4    SF3B1    FGFR1    MAPK1    SMAD4    FGFR2    MAX    SMO    FGFR3    MDM4    SPOP   

 

Full length

ARID1A    PALB2    ATM    PIK3R1    ATR    PMS2    ATRX    POLE    BAP1    PTCH1    BRCA1    PTEN    BRCA2    RAD50    CDK12    RAD51    CDKN1B    RAD51B    CDKN2A    RAD51C    CDKN2B    RAD51D    CHEK1    RB1    CREBBP    RNF43    FANCA    SETD2    FANCD2    SLX4    FANCI    SMARCA4    FBXW7    SMARCB1    MLH1    STK11    MRE11A    TP53    MSH2    TSC1    MSH6    TSC2    NBN    NF1    NF2    NOTCH1    NOTCH2    NOTCH3   

 

CNV (=copy number variation)

AKT1    MDM2    AKT2    MDM4    AKT3    MET    ALK    MYC    AR    MYCL    AXL    MYCN    BRAF    NTRK1    CCND1    NTRK2    CCND2    NTRK3    CCND3    PDGFRA    CCNE1    PDGFRB    CDK2    PIK3CA    CDK4    PIK3CB    CDK6    PPARG    EGFR    RICTOR    ERBB2    TERT    ESR1    FGF19    FGF3    FGFR1    FGFR2    FGFR3    FGFR4    FLT3    IGF1R    KIT    KRAS   

 

Fusions

AKT2    NF1    ALK    NOTCH1    AR    NOTCH4    AXL    NRG1    BRAF    NTRK1    BRCA1    NTRK2    BRCA2    NTRK3    CDKN2A    NUTM1    EGFR    PDGFRA    ERBB2    PDGFRB    ERBB4    PIK3CA    ERG    PPARG    ESR1    PRKACA    ETV1    PRKACB    ETV4    PTEN    ETV5    RAD51B    FGFR1    RAF1    FGFR2    RB1    FGFR3    RELA    FGR    RET    FLT3    ROS1    JAK2    RSPO2    KRAS    RSPO3    MDM4    TERT    MET    MYB    MYBL1   

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